生化鉴定条使用注意事项及讨论

1、做生化鉴定前一定要进行纯化吗？

  对单一菌种进行鉴定，不需要进行纯化操作，只需要保证菌体新鲜就行。但对于在选择性培养基上分离出的菌，进行纯化后在进行鉴定。原因如下：

  （1）选择性培养基上初步分离的菌落，不一定是单一菌种形成的，若有其它菌种，会干扰试验结果，造成误判；

  （2）选择性培养基成分复杂，挑菌时若沾取了少量培养基，有可能会对鉴定结果造成干扰；

  （3）选择性培养基中通常含有一些抑制成分，平板上长出的菌落会受到不同程度的抑制或损伤，活力不好，不利于生化结果的观察和判定；

  （4）选择些平板上长出的菌落通常较小，若需要做很多生化试验，有可能出现菌体不够用的情况（通常每挑一下接种后，要进行烧环灭菌再进行下一次挑菌，浪费较多）。

  上面两种情况，无论是为了得到新鲜菌体，还是为了得到较纯的菌落，都需要在营养琼脂平板上进行划线培养。所以这是菌种生化鉴定前首先要做的准备工作，直接使用初筛菌，试验结果可能会有一些差异，造成误判（如图1）。

图1 使用纯化菌（左）和初筛菌（右）接种鉴定条培养结果的差异

2、接种鉴定条时，一定要用菌悬液来接种吗？

  鉴定条说明书中要求“取一内盛2mL无菌水或无菌生理盐水试管，用接种针挑取纯化菌落至无菌水中仔细研磨制成0.5麦氏浊度的均一细菌悬液，每孔滴入100mL菌悬液，其中固体和半固体生化管采用穿剌接种（参考：HBI微生物生化鉴定条 ）”。也就是说要用均匀的菌悬液进行接种。这样要求，是为了尽量使每个孔中接入的菌量相当，使各生化反应趋于同步。如果使用接种针或接种环直接挑菌进行接种，会导致各个孔中接菌量差别很大，从而导致培养结果有所差异（如图2-a、图2-b）。

图2-a  用菌悬液接种的试验结果（氨基酸对照管变黄，正确）

图2-b  用接种环挑菌接种的试验结果（氨基酸对照管紫色，异常）

3、需要每个孔都换枪头吗？

  接种过程中，如果能保证每次往培养基孔中滴加菌液时，不会沾染枪头，则从头到尾用一个枪头即可；如果中间出现沾染，则需及时更换枪头；对于氨基酸和氨基酸对照孔，尽量不用同一个枪头，以免少量的沾染，影响试验结果。有的人会执意用接种针挑取菌体进行接种，这时候更要注意，每接种一个孔，都要进行烧环灭菌，主要是为了清除接种针或接种环上沾附的少量培养基，以免对后面孔的试验结果造成干扰。坚决不能用一个针挑取菌苔后，连续往鉴定条的每个孔中一次性接种完成。这样很可能造成生化结果的混乱或者试验失败。

4、讨论：

  对于菌种纯化，有些标准中也有描述，可以从选择性培养基平板上挑菌进行某项生化试验，如《GB 4789.4  食品安全国家标准  食品微生物学检验  沙门氏菌检验》中相关内容是这样描述的：

  但是为了保险，少走弯路，本人还是建议先进行纯化后，制成菌悬液再进行接种、培养。这样也不会因为某一两个孔的结果不好，而再重新使用一整套生化鉴定条，造成浪费。文中所列的几种异常情况，不一定每次都能碰到，但是如果不按正常操作进行试验，试验过程中出现各种这样或那样异常现象的几率会更大，阻碍试验进程。

  另外，为了保证结果的一致性和实效性，可以将菌液制备得尽量浓一些，也就是说每个孔中接菌量可适当加大。

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