洋葱伯克霍尔德菌检验方法及结果判断

  洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）（1950年Burkholder自洋葱根部分离）因引起洋葱腐烂而得名，原归类假单胞菌属，定名为洋葱假单胞菌。1992年，Yabuuchi等正式将该菌与类鼻疽伯克霍尔德菌、唐菖蒲伯克霍尔德菌、皮氏伯克霍尔德菌和鼻疽伯克霍尔德菌等归为一个新属，即伯克霍尔德菌属。该菌在医院环境中广泛存在，尤其在囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）和慢性肉芽肿病（chronic granulomatous disease，CGD）患者痰液中易分离到。目前国内外研究资料提示该菌临床分离率不断增加，且对现有的抗菌药物具有较高的耐药性。

  洋葱伯克霍尔德菌是一种带尾丝革兰阴性杆菌，在血平板上菌落呈淡黄色，湿润、凸起、浑浊，不溶血；麦康凯平板上为乳糖不发酵菌落，细小而清晰，延长培养48h后中心呈粉红色。

二、参考标准

  《SN/T 4684-2016 进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法》

三、检验程序

  洋葱伯克霍尔德菌检验程序见图1。

图1 洋葱伯克霍尔德菌检验程序

四、操作步骤和结果判断

4.1 增菌培养

  按照GB 7918.1方法制备1:10化妆品稀释液，取稀释液10mL加到90mL含多粘菌素B的SCDLP增菌液中，于36℃±1℃培养24h，移取1mL，转种于10mL含庆大霉素的BCSA增菌液内，于36℃±1℃培养18 h~24 h。

  含多粘菌素B的SCDLP增菌液原理：酪蛋白胨和大豆蛋白胨提供微生物生长所需的氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；磷酸氢二钾为培养基pH的缓冲剂；葡萄糖为可发酵的糖类；卵磷脂和吐温80能中和防腐剂，并能起到在乳浊液中分散物质的功能，卵磷脂能中和季铵盐，吐温80可中和酚、六氯酚、福尔马林，两者结合可中和乙醇；多粘菌素B可抑制铜绿假单胞菌和其他伯克霍尔德菌生长。

  用法：称取本品31.0g，另取吐温80 7.0g加热溶解于1000mL蒸馏水中，分装，121℃高压灭菌20分钟，冷却，使用前，按每100mL培养基中加入过滤除菌的多粘菌素B 25000U，混匀，备用。

  洋葱伯克霍尔德菌在含多粘菌素B的SCDLP增菌液中生长良好，结果如图2所示：

图2 在含多粘菌素B的SCDLP增菌液中的生长情况

  含庆大霉素的BCSA增菌液原理：酪蛋白胨、酵母提取物提供细菌生长的基本营养；氯化钠维持渗透压；庆大霉素为广谱抗生素，对多数假单胞菌属、变形杆菌属、大肠菌群、葡萄球菌属、需氧芽孢杆菌属等多种革兰氏阴阳性菌有较强的抗菌活性，结晶紫主要抑制革兰氏阳性菌和念珠菌的生长；乳糖和蔗糖为可发酵碳源；酚红为酸碱指示剂，洋葱伯克霍尔德氏菌可氧化发酵蔗糖产少量酸，不发酵乳糖，生长时培养基微变黄色。

  用法：称取本品36.58g，加热煮沸，完全溶解于1000mL蒸馏水中，分装三角瓶或试管，115℃高压灭菌15分钟，使用前，按每100mL培养基中加入过滤除菌的庆大霉素1mg，混匀，备用。

  洋葱伯克霍尔德菌在含庆大霉素的BCSA增菌液中生长良好，结果如图3所示：

图3 在含庆大霉素的BCSA增菌液中的生长情况

4.2 分离培养

  分别用接种环取BCSA增菌液一环，划线接种于BCSA琼脂（含多粘菌素B、庆大霉素）平板和麦康凯琼脂（含多粘菌素B、庆大霉素）平板，于32℃±1℃培养48 h，观察各个平板上生长的菌落。

  含多粘菌素B、庆大霉素的BCSA琼脂原理：酪蛋白胨、酵母提取物提供细菌生长的基本营养；氯化钠维持渗透压；庆大霉素为广谱抗生素，对多数假单胞菌属、变形杆菌属、大肠菌群、葡萄球菌属、需氧芽孢杆菌属等多种革兰氏阴阳性菌有较强的抗菌活性；结晶紫主要抑制革兰氏阳性菌和念珠菌的生长；乳糖和蔗糖为可发酵碳源；酚红为酸碱指示剂，洋葱伯克霍尔德氏菌可氧化发酵蔗糖产少量酸，不发酵乳糖，生长时培养基微变黄色。

  USP42标准中洋葱伯克霍尔德氏菌特征为生长带有黄色光环的绿棕色菌落，或被粉红色区域包围的白色菌落。

  用法：称取本品50.58g，加热煮沸，完全溶解于1000mL蒸馏水中，分装三角瓶，115℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃左右时，按每100mL培养基中加入过滤除菌的多粘菌素B 60000U和庆大霉素1mg，混匀，倾入无菌平皿，备用。

  洋葱伯克霍尔德菌在含多粘菌素B、庆大霉素的BCSA琼脂平板上的菌落为菌落呈淡黄色至淡红色，表面光滑，周围培养基变红，结果如图4所示：

洋葱伯克霍尔德菌ATCC 25416

图4 BCSA琼脂（含多粘菌素B、庆大霉素）平板上的菌落特征

  含多粘菌素B、庆大霉素的麦康凯琼脂原理：蛋白胨提供细菌生长的基本营养；氯化钠维持渗透压；多粘菌素B主要抑制多数革兰氏阴性细菌的生长，庆大霉素为广谱抗生素，对多种革兰氏阴性菌和阳性菌均有抑制作用；牛胆盐主要可抑制革兰氏阳性菌的生长；乳糖为可发酵碳源；中性红为酸碱指示剂，洋葱伯克霍尔德氏菌不发酵乳糖，菌落通常呈黄褐色或微红色，周围培养基通常不变色或因产碱变为橙黄色，而发酵乳糖的杂菌在培养基上则呈现桃红色，菌落周围可有沉淀环，与洋葱伯克霍尔德氏菌区分开来。

  用法：称取本品54.03g，加热煮沸，完全溶解于1000mL蒸馏水中，分装三角瓶，115℃高压灭菌20分钟，冷却至50℃左右时，按每100mL培养基中加入过滤除菌的多粘菌素B 25000U和庆大霉素1mg，混匀，倾入无菌平皿，备用。

  洋葱伯克霍尔德菌在含多粘菌素B、庆大霉素的麦康凯琼脂平板上的典型菌落为浅黄褐色圆形菌落，表面光滑，周围培养基通常不变色或因产碱变为橙黄色，结果如图5所示：

洋葱伯克霍尔德菌ATCC 25416

图5 麦康凯琼脂（含多粘菌素B、庆大霉素）平板上的菌落特征

4.3 鉴定

4.3.1 初筛

  自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，同一菌株接种于2支葡萄糖氧化/发酵管，其中一支加灭菌液体石蜡封口，另一支不封口，于36℃±1℃培养24h，二者均变黄为葡萄糖发酵型，未加石蜡管变黄而加石蜡管不变色为葡萄糖氧化型。同时在营养琼脂平板上划线纯化，于36℃±1℃培养24 h，选择葡萄糖氧化型（加石蜡管不变黄，不加石蜡管变黄）的纯培养物继续进行鉴定；洋葱伯克霍尔德菌的葡萄糖生化管结果如图6所示。

图6 葡萄糖氧化/发酵管试验结果

4.3.2 革兰氏染色

  挑取可疑菌落涂片，进行革兰氏染色。显微镜下观察，洋葱伯克霍尔德菌为革兰氏阴性杆菌，如图7所示。

图7 革兰氏染色镜检结果

4.3.3 氧化酶试验

  用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。洋葱伯克霍尔德菌为迟缓型氧化酶阳性（紫红色、紫色或深蓝色），反应时间约为2min~10min，如图8所示。

  注：实验中切勿使用镍/铬材料。

图8 氧化酶试验结果

4.3.4 过氧化氢酶试验

  用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落，置于洁净载玻片上，滴加3%过氧化氢溶液，观察气泡产生情况。洋葱伯克霍尔德菌为迟缓产气，1s后缓慢出现气泡，如图9所示。

图9 过氧化氢酶试验结果

4.3.5 蔗糖氧化

  挑取可疑菌落接种于蔗糖氧化培养基，36℃±1℃培养24h，培养基变黄色为阳性。洋葱伯克霍尔德菌为阳性反应，如图10所示。

图10 蔗糖氧化试验结果

4.3.6 枸橼酸盐利用

  挑取可疑菌落接种于西蒙氏枸橼酸盐培养基，36℃±1℃培养24h，培养基变蓝色为阳性，绿色为阴性。洋葱伯克霍尔德菌为阳性反应，如图11所示。

图11 西蒙氏枸橼酸盐利用结果

4.3.7 七叶苷利用

  挑取可疑菌落接种于七叶苷培养基，30℃±1℃培养24h，培养基变黑色为阳性，不变色为阴性。洋葱伯克霍尔德菌为阳性反应，如图12所示。

图12 七叶苷利用结果

4.3.8 替代试验

  可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，根据4.3.1的初步判断结果，对可疑菌落进行鉴定。

4.4 结果报告

  综合以上试验结果，报告10g（mL）样品中检出或未检出洋葱伯克霍尔德菌。

五、附录：

  《GB/T 7918.1-1987 化妆品微生物标准检验方法 总则》样品处理方法

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。