CAR-T细胞治疗技术介绍

CAR-T细胞治疗技术介绍

CAR-T（全称Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy）是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法的英文缩写。CAR-T多年前就已经出现，但是在近几年才被应用到临床上。2017年8月31日，个基因治疗方法CAR-T细胞药物Kymriah被美国FDA批准上市。这标志着一个的精准医疗时代的到来。

T细胞是淋巴细胞的主要组分，它通过细胞免疫应答消灭特异性抗原。细胞免疫的作用主要有两种：与靶细胞特异性结合，破坏细胞膜，直接杀伤靶细胞；释放淋巴因子，使免疫效应扩大和增强。天然T细胞需要MHC分子呈递多肽与T细胞受体TCR结合才能识别病原或，而它们有多种逃逸机制。CAR-T则是在T细胞中通过基因工程转入能够产生嵌合抗原受体(CAR)的序列，使T细胞识别更加具有特异性并且不受HLA限制，从而有效的消灭细胞。CAR-T细胞治疗流程主要包括：

1.    自体T细胞的分离及激活

首先，从患者体内的外周血中分离白细胞，其他成分返回血液循环。当白细胞收集足够后，对T细胞进行富集，富集可以通过密度梯度离心法完成。T细胞亚群的分离通过CD4/CD8特异性抗体或者表面标记偶联磁珠进行分离。通过CD3及CD28等抗体刺激，活化分离的细胞。

2.    CAR-T细胞的制备

CAR-T细胞的制备是通过基因工程技术给T细胞加入一个能识别细胞、同时激活T细胞、终杀死细胞的嵌合受体。相关基因工程技术包括慢病毒、γ逆转录病毒、睡美人转座子系统或mRNA转染、mRNA电转等。制备完成后通过细胞培养技术在体外大规模培养CAR-T细胞，使其数量达到治疗水平。

3. 将体外培养的CAR-T细胞回输至病人体内

CAR-T在患者体内发挥功能， CART细胞一旦发现癌细胞，不仅会杀死它，还会开始增殖，创造出庞大的灭癌大军。

据报道，目前中国国内已经有数十家企业与医疗机构参与CAR-T项目研究，2018年3月12日，南京传奇生物的CAR-T制剂成为国内申报临床研究的获批项目。2018年9月7日，中国医药生物技术协会发布了《嵌合抗原受体修饰T细胞（CART细胞）制剂制备质量管理规范》，为方兴未艾的CAR-T细胞治疗技术提供了可靠的依据，保证CAR-T细胞制剂在临床研究和应用时的质量，让这一技术得以的服务于人类。

对于CAR-T细胞治疗来说，CAR-T细胞制备是重要的。这一步骤结合了基因工程和细胞培养技术，具有很高的技术难度。

为了制得合适的CAR-T细胞，我们需要通过基因技术将能生产CAR的序列传导到T细胞中，通常使用多的技术是慢病毒比如人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 慢病毒载体，可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。慢病毒可有效地感染多种类型的细胞，如神经元细胞、干细胞等。我们可以通过人工合成的CAR元件克隆至慢病毒载体，包装假病毒。再用这些假病毒感染从患者体内分离的T细胞，生产CAR-T细胞。生产出来的CAR-T细胞数量通常不能满足治疗的需要，这就需要对CAR-T细胞进行培养，使细胞数量达到使用要求。

在这些相关的实验中，大家通常会把注意力关注在载体、细胞、培养基的好坏中，但是实验用水却往往会被忽视。实际上，水对于整个实验来说，起到了重要的辅助作用。在细胞培养中，超纯水用来配置和稀释液体培养基、各种缓冲液等试剂，润洗器具、容器。纯水用来清洗器具、容器，给水浴锅、灭菌器，培养箱用水（水套式）等设备提供进水。如果细胞培养用水含有杂质，会带来很大的影响：

离子：改变渗透压

微生物：直接污染，改变微环境（如 pH），影响增殖，死后释放内毒素等

内毒素：改变细胞外形、活化细胞、促进或抑制细胞分裂、影响细胞附着等

有机物：水体中溶解性和悬浮性有机物含碳的总量。间接反映出水中细菌和内毒素含量的高低。

对于CAR-T细胞治疗来说，不但需要满足《中国药典》2015年版的相关要求，还应该满足细胞培养的特别需要。Merck  Sigma-Aldrich建议细胞培养应使用超纯水，无细菌，内毒素 < 0.005 Eu/ml，pH 5.0 - 7.0；Thermo Scicentific要求使用无细菌，内毒素<0.005 Eu/ml的超纯水。所以CAR-T细胞治疗必须使用高品质的超纯水系统。乐枫新一代 Genie G 智能型一体化超纯水系统一机两水，可以同时制备EDI 纯水和超纯水。Genie G 生产的超纯水不但符合《中国药典》2015年版的数据要求，还超过CLSI临床实验室试剂纯水CLRW的要求。取水终端采用RephiBio过滤器，确保产水无细菌，内毒素 < 0.001 Eu/ml，RNase < 0.5 pg/ml，DNase < 10 pg/ml。Genie G可储存2年的水质报告，具有可追溯性。乐枫还提供中英文的3Q验证服务，可帮助用户实验室顺利通过美国FDA或者欧盟EMA的相关认证。Genie G可以充分满足高端生命科学技术整体用水的需求，质量不输进口设备，用户使用起来，完全可以“用水无忧”。

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