铜绿假单胞菌检验方法

一、简介

  铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃±1℃条件下能生长。

  铜绿假单胞菌在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在。对人有致病力，常引起人皮肤化脓感染，特别是烧伤、烫伤、眼部疾病患者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症，因此，在化妆品卫生标准中规定不得检出铜绿假单胞菌。

二、参考标准

  《化妆品安全技术规范》（2015年版）

三、检验流程

  1.增菌培养

  取样品稀释液加到SCDLP液体培养基中，置36℃±1℃培养18h-24h。如有铜绿假单胞菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。结果如图1所示：

a：空白对照；b：铜绿假单胞菌

图1 SCDLP液体培养基培养结果

  2.分离培养

  从培养液的薄膜处挑取培养物，划线接种在溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上，置36℃±1℃培养18h-24h。

  铜绿假单胞菌生长过程中会产生两种水溶性色素：黄色的荧光素和绿色的绿脓菌素，所以在溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上菌落呈黄绿色。铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。结果如图2所示：

图2 铜绿假单胞菌在溴化十六烷基三甲铵琼脂上的培养结果

  在缺乏溴化十六烷基三甲铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平板上，置36℃±1℃培养24h±2h。

  铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基呈红色，其他菌不生长。结果如图3所示：

图3 铜绿假单胞菌在乙酰胺培养基上的培养结果

  3.染色镜检

  挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检结果为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。铜绿假单胞菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，呈红色杆状。结果如图4所示：

图4 铜绿假单胞菌的革兰氏染色结果

  4.氧化酶试验

  用无菌玻璃棒挑取铜绿假单胞菌可疑菌落涂在氧化酶试纸上，在30s内变为蓝色或蓝紫色为阳性，2min内不变色为阴性。铜绿假单胞菌在氧化酶试纸上显蓝色，为阳性。结果如图5所示：

a：铜绿假单胞菌；b：大肠埃希氏菌

图5 氧化酶试验结果

  5.绿脓菌素试验

  取可疑菌落2-3个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置36℃±1℃培养24h±2h，结果如图6所示；向试管中加入氯仿3-5mL，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1 mol/L的盐酸1mL左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在，结果如图7所示：

a：空白对照；b：大肠埃希氏菌；c：铜绿假单胞菌

图6 绿脓菌素测定培养基培养结果

a：大肠埃希氏菌；b：铜绿假单胞菌

图7 绿脓菌素试验结果

  6.硝酸盐还原产气试验

  挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在硝酸盐胨水培养基中，置36℃±1℃培养24h±2h，观察结果。

  铜绿假单胞菌在硝酸盐胨水培养基内的小倒管中有气体，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。结果如图8所示：

a：空白对照；b：大肠埃希氏菌；c：铜绿假单胞菌

图8 硝酸盐还原产气试验结果

  7.明胶液化试验

  取铜绿假单胞菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置36℃±1℃培养24h±2h，取出放置于4℃±2℃冰箱10-30min，观察结果。

  呈溶解状或表面溶解时即为明胶液化试验阳性；如凝固不溶者为阴性。铜绿假单胞菌呈溶解状态，为阳性。结果如图9所示：

a：空白对照；b：接菌培养后；c：铜绿假单胞菌4℃放置后；d：大肠埃希氏菌4℃放置后

图9 明胶液化试验结果

  8.42℃生长试验

  挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，置于42℃±1℃培养箱中，培养24h-48h。铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。结果如图10所示：

a：空白对照；b：铜绿假单胞菌

图10 普通琼脂斜面培养基培养结果

  9.检验结果报告

  被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气、42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。

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