（Copure ® ALA/PRS）
一、实验目的
本研究利用固相萃取法作为样品的前处理方法，HPLC法作为分析方法，检测水产品中孔雀石绿含量。该方法 可简化样品的前处理过程，节省有机溶剂的使用，操作简便。
二、实验目标物
孔雀石绿(CAS:569-64-2) 。
三、应用范围
本方法适用于水产品中孔雀石绿的检测的HPLC检测及确证。
四、参考标准
《GB/T 20361-2006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相荧光检测法》。
《GB/T 19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》。
五、实验材料
biocomma ® Copure ® 酸性氧化铝固相萃取柱1000mg/3mL(Cat. No. COALA31000)。
biocomma ® Copure ® PRS固相萃取柱500mg/3mL(Cat. No. COPRS3500)。
六、实验步骤
1、样品提取
准确称取鱼肉样品5.0 g于50 mL离心管1中，加入1.5 mL 20%的盐酸羟胺，2.5 mL 1.0 mol/L的对甲苯磺酸， 5.0 mL乙酸钠-对甲苯磺酸缓冲液（4.95 g无水乙酸钠及0.95 g 对-甲苯磺酸，用乙酸调PH至 4.5，定容至1 L），匀浆机均质30 s（10000 r/min）。加入10 mL乙腈，剧烈振摇30 s。加入5 g酸性氧化铝，震荡30 s。离 心机离心10 min（3000 r/min）,取上清液转移至预先加好10 mL水、2 mL二甘醇的离心管2中。加入10 mL乙 腈至离心管1中，重复上述提取一次，合并乙腈层。
离心管2中加入15 mL二氯甲烷，振荡10 s，离心10 min（3000 r/min），取二氯甲烷层于梨形瓶中。继续用5 mL乙腈、10 mL二氯甲烷重复上述提取一次，合并两次提取的二氯甲烷层。将提取液45℃旋转蒸发至1 mL， 再用2.5 mL乙腈溶解，待净化。
2、SPE柱净化
(1) 活化：按照酸性氧化铝柱在上，PRS柱在下顺序将两柱串联，固相萃取柱使用前使用5 mL乙腈活化。
(2) 上样和洗脱：将梨形瓶中的待净化液转移至酸性氧化铝柱中净化，梨形瓶使用2.5 mL×2的乙腈洗涤瓶两次，弃去酸性氧化铝柱，吹PRS柱至近干，在不抽真空的情况下，加入5 mL乙腈-0.1 mol/L乙酸铵 (pH=10)(25:75, v/v)，收集洗脱液。
(3) 重新溶解：洗脱液45 ℃氮吹至近干，用1 mL乙腈定容，过0.45 μm滤膜，待上机测试。
3、HPLC条件
设 备：Waters Alliance 2695
色谱柱 ：Welch Ultimate XB-C18 (4.6×250 mm，5μm)
检测器 ：Waters 2487 紫外检测器
流动相：A：乙腈 B：0.05 mol/L乙酸铵缓冲溶液
洗脱方式：梯度洗脱
表1 梯度洗脱条件
流速：1.2 mL/min
检测波长：618 nm
进样体积:50 μL
七、实验结果
1、0.1 mg/kg鱼肉中孔雀石绿的添加回收结果
表2 0.1mg/kg鱼肉中孔雀石绿的添加回收结果
2、添加水平为0.1 mg/kg鱼肉中孔雀石绿检测的液相色谱图
图1 添加水平为0.1 mg/kg鱼肉中孔雀石绿检测的液相色谱图
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